产品描述

Cas12b High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit是基于T7 RNA聚合酶的体外RNA转录试剂盒，可高效进行 Cas12b sgRNA 的制备。使用本试剂盒时，仅需按照本试剂盒说明书设计并合成 Target AntisenseOligo，每次反应可获得 50-150 μg 的 Cas12b sgRNA。获得的 Cas12b sgRNA 可应用于 CRISPR 分子诊断、基因编辑等。

产品组分

a. Cas12b Control Target Antisense Oligo 是阳性对照，可与 Cas12b Sense Oligo 退火延伸后，作为转录模板使用，用来测试体外转录体系的反应效率。在 37°C孵育 30 min 条件下，对照转录反应体系生成的 sgRNA 产量≥50 μg，其产量在纯化后由 NanoDrop 测定。在变性条件下进行 TBE-Urea gel 电泳，可观察到 sgRNA 单条带大小约为 110 nt。

b. 本产品中 Part B 组分（纯化磁珠，#3620F）与 Part A 组分保存条件不同，因此 Part B 组分需单独运输！

保存条件

Part A 组分-20℃保存，有效期 1 年。

需自备的实验物品

• PCR 仪
• 无水乙醇
• 异丙醇
• 无核酸酶水
• 96 孔磁力架
• 96 孔板或 PCR 8 联排管
• 移液器及吸头

Cas12b sgRNA 转录引物设计

1.Cas12b sgRNA 转录原理示意图

Cas12b sgRNA 转录原理示意图如图 1 所示，试剂盒中已提供 Cas12b Sense Oligo，只需根据待测目标序列设计 Target Antisense Oligo。

图 1. Cas12b sgRNA 转录原理示意图

2.Target Antisense Oligo 设计举例

2.1 选取 20 bp 的 Target Sequence，其中方框部分为 PAM 序列，下划线部分为 Target Sequence。

2.2 根据选取的 Target Sequence 设计 Target Antisense Oligo，则其序列应为：

其中波浪线部分为 Cas12b sgRNA scaffold 的部分反向互补序列，为固定序列。下划线部分为 Target Sequence。

2.3 转录得到的 Cas12b sgRNA 序列应为：

波浪线部分为AapCas12b sgRNA scaffold 序列，下划线部分为 Target Sequence 反向互补序列。

实验流程

1.DNA 转录模板制备

Cas12b Sense Oligo 与 Target Antisense Oligo 退火延伸反应完成后便可作为转录模板使用。

1.1 退火体系配制

1.2 PCR 退火程序设置

2.Cas12b sgRNA 体外转录

2.1 按下表试剂的顺序进行体外转录反应体系的配制：

· 请将试剂解冻并完全混匀后再使用。

· 5 × TranscriptMax Reaction Buffer 中含有亚精胺，而亚精胺与核酸容易形成复合体沉淀，DNA 转录模板尽量最后加入到体系中。

· 上述反应体系的总体积为 20 μL，可适当等比例调整反应体系。

2.2 将上述试剂充分混匀，然后短暂离心，在 37°C下孵育 2-4 h 进行体外转录，延长转录时间可提高转录产量，如果转录产物用于 CRISPR 一步法（一管法）检测，推荐过夜转录 12-16 h。

2.3 37℃孵育结束后，按照下表配制 30 μL 的 DNase Ⅰ反应液加入到 20 μL 的体外转录产物中，以去除转录体系中的 DNA 模板。

DNase Ⅰ反应条件：37℃，30 min。

3.Cas12b sgRNA 转录产物磁珠纯化

3.1 首先将磁珠从 4℃冰箱中取出，在室温中放置约 30 min，使其温度平衡至室温。颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀，吸取 25 μL 磁珠和 50 μL 异丙醇加入到 50 μL 待纯化的 crRNA 样品中，用移液器吹打充分混匀。

3.2 室温孵育 5 min，使 RNA 结合到磁珠上。

3.3 将样品置于磁力架上 5 min，待溶液澄清后，小心移除上清。

3.4 保持样品置于磁力架上，加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇，漂洗磁珠，室温孵育 30 s，小心移除上清。

注：漂洗时使用的 80% (v/v)乙醇需要使用 Nuclease-free water 新鲜配制，配制方法举例如下：分别量取8 mL 无水乙醇和 2 mL Nuclease-free water，混匀后可得 10 mL 80% (v/v)乙醇。

3.5 重复步骤 4，共漂洗 2 次。

3.6 保持样品始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠 5 min。

注：磁珠开盖晾干时要避免过分干燥，如果磁珠出现龟裂，则提示磁珠过分干燥，此时 RNA 的洗脱效率会降低。

3.7 将样品从磁力架上取出，加入 50 μL Nuclease-free water，用移液器吹打以充分混匀，室温静置 5 min。

3.8 将样品置于磁力架 5 min，待溶液澄清后，小心转移上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中，即得到纯化后的 Cas12b sgRNA。

3.9 将纯化后的sgRNA于70℃处理10 min，以灭活残留的DNase I。

注意事项

1. 本试剂盒制备的 sgRNA 为目前最常用的 AapCas12b sgRNA 或 AacCas12b sgRNA，如果要制备其它类型的 Cas12b sgRNA，只需要根据 Cas12b sgRNA scaffold 序列重新设计 Cas12b Sense Oligo 与 Target Antisense Oligo 即可。

2. 本试剂盒的 Part B 组分（纯化磁珠，#3620F）单独运输。磁珠保存条件为 2-8℃，严禁冻存和高速离心操作。

3. 由于 DNaseⅠ对不同 DNA 的消化能力存在差异，如果纯化完成后仍然存在残留模板 DNA，可以再次进行 DNaseⅠ处理，然后再次纯化。

4. 转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。例如模板 DNA 中混入 RNase、EDTA、NaCl 等高盐溶液均可显著抑制体外转录反应，导致 RNA 合成量减少。

5. 实验过程应选用无核酸酶的枪头和离心管。