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产品概述
产品描述
LbuCas13a 核酸酶(又名 C2c2)是依赖于 crRNA 介导的 RNA 内切核酸酶，来源于 Leptotrichia buccalis菌株。在靶标单链 RNA 存在 PFS 序列的情况下，可特异地识别并剪切靶标 RNA。此外，Cas13a 也具有反式剪切活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，即当 LbuCas13a 蛋白与 crRNA、靶标 RNA 结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列单链 RNA 的反式剪切活性，将体系中的任意序列单链 RNA 切碎。该活性也被用于靶标核酸的快速检测试剂盒的开发。例如，Broad 研究所的张锋团队便利用 Cas13a 蛋白开发了名为“SHERLOCK”的下一代分子诊断系统(详细信息请参考 PMID: 28408723) 。
产品组分
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组分 |
32134-01 (100 pmol) |
32134-03 (1,000 pmol) |
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100 pmol |
1,000 pmol |
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1 mL |
1 mL |
LbuCas13a Nuclease (10 μM) 
10 × HOLMES Buffer for Cas13a
a.LbuCas13a Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
保存条件
组分-20℃储存；≤ 0℃运输。
活性定义
在总体积为 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer for Cas13a [pH 7.6]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内剪切 1 pmol ssRNA 探针所需的 Cas13a 酶量定义为 1 transU。
实验流程
1.反式剪切实验
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × HOLMES Buffer for Cas13a |
2 μL | 1 × |
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10 μM LbuCas13a Nuclease |
0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
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10 μM crRNA |
0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
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10 μM Target RNA |
0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
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10 µM ssRNA Reporter (FAM-BHQ1) |
0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
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Nuclease-free Water |
Up to 20 μL |
· 反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，LbuCas13a Nuclease 可用 1 × HOLMES Buffer for Cas13a 稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的 Cas13 酶长期保存，请使用 Cas13 Dilution Buffer，#32013），crRNA、Target RNA 及 ssRNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀释，但极低浓度的Target RNA（例如 LOD 实验）建议用 0.1% Tween 20 稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
· 实时荧光定量 PCR 仪检测荧光信号，37℃反应，每 30 sec 采集一次荧光信号。
实验结果
Fig 1. Results of Cas13 collarteral cleavage at different concentrations of target RNA.