产品描述

Un1Cas12f1(又名Cas14a)是依赖于crRNA和tracrRNA共同介导的(或融合后的sgRNA单独介导的)DNA核酸内切酶，能特异结合并切割靶标ssDNA，且不受PAM位点的限制。此外，Un1Cas12f1也能以PAM依赖的方式特异地剪切靶标dsDNA，使DNA双链断裂并生成粘性末端。与其他Cas12蛋白类似，Un1Cas12f1蛋白同样拥有针对ssDNA的反式切割活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，双链或单链DNA靶标均能激活Un1Cas12f1的反式剪切活性，即当Un1Cas12f1蛋白与sgRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列ssDNA的反式剪切活性，将体系中的任意序列ssDNA切碎。
相比于其他的Cas蛋白，Cas12f1蛋白的分子量普遍较小(400~700AA)，其中Un1Cas12f1的分子量约61.5 kD，可用于靶标核酸的分子检测(详细信息请参考PMID: 30337455)。

产品优势

✽ 标准化定义的反式剪切活性：在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer for Cas12f [pH 8.5]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内切割1 pmol ssDNA探针所需的Cas12f酶量定义为1 transU。本公司提供的Cas酶transU数值可于COA检测报告中查询。

产品组分

a.Un1Cas12f1 Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；

保存条件

组分-20℃储存；≤ 0℃运输。

实验案例

1.Un1Cas12f1的反式剪切：本实验中使用3种ssDNA靶标序列，分别命名为Target ssDNA1，Target ssDNA2，Target ssDNA3，并针对不同靶标序列设计了对应的sgRNA。同时，在剪切反应体系中加入ssDNA报告探针,该探针5′端标记荧光报告基团(FAM)，3′端标记荧光淬灭基团(BHQ1)。实验结果表明，当Un1Cas12f1在对应sgRNA引导下与特异靶标ssDNA形成三元复合物后，便会被激活针对ssDNA的高效反式剪切活性，将体系中的ssDNA报告探针切碎，从而发出荧光信号。

图1:不同ssDNA靶标存在下Un1Cas14a1反式剪切的结果。
 

实验流程

1.反式剪切实验

◆ 反式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。

◆ 反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，Un1Cas12f1 Nuclease可用1×HOLMES Buffer for Cas12f稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。

◆ 反式剪切体系中探针的用量和预期反应到达平台期的时间可参考各批号Cas酶transU的具体数值，详见本公司提供的COA检测报告。

◆ 实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。