实验方法：

1.蛋白提取：

  1.1制备细胞裂解产物

1. 向细胞沉淀中加入 95-110ul 的 RIPA 裂解缓冲液（含蛋白磷酸酶抑制剂）,用移液器快速吹打，将细胞团打散，冰浴中放置10分钟，并每隔 5 分钟在漩涡混合仪上振荡 30 秒；

2. 12000g 4℃离心 10 分钟，将上清转移到新的离心管中，即得细胞总蛋白产物；

1.2制备组织裂解产物

1. 取 50-100 mg 组织在液氮中快速研磨成粉末状；

2. 加入 0.5-1 ml 预冷 RIPA 裂解缓冲液（含蛋白磷酸酶抑制剂）；

3. 然后在冰浴中放置 10 分钟， 并每隔 5 分钟在漩涡混合仪上振荡 30 秒；

4. 12000g 4℃离心 10 分钟，将上清转移到新的离心管中，即得组织总蛋白产物；  

2.浓度测定：

  标准品准备，使用BSA标准品，浓度分别为0.5ug/ul，0.4ug/ul，0.3ug/ul，0.2ug/ul，0.1ug/ul，0.05ug/ul，0.025ug/ul，总共8个梯度作为标准品对照。

  BCA蛋白定量， BCA液每孔200ul与硫酸铜液4ul混合，配制成为BCA蛋白定量工作液使用。

上样，标准品与样品每孔上样20ul，之后加入BCA工作液，37度温箱孵育30mins。酶标仪562nm处读出OD值。

  绘制标准曲线，以标准品浓度ug/ul为横轴，OD值为纵轴，绘制线性方程，线性相关性应大于0.995，根据标准曲线方程代入测定的样品OD值，计算出样品浓度ug/ul。

详情请见数据分析表蛋白浓度检测表

3.制胶：

  根据目的蛋白的分子量，选择合适的胶浓度，以配制10%的胶为例，一块胶需要5ml的分离胶，配制方案：H₂O 1.95ml，30%Acrylamide 1.7ml，1.5MTris-HCl pH=8.8 1.3ml，10%SDS 52ul，10%APS 50ul，TEMED 2ul。充分混匀凝胶，避免气泡产生，灌胶后，使用2ml去离子水水封。

  配制浓缩胶，1块胶需要2ml浓缩胶，配制方案：H2O 1.4ml，30%Acrylamide 0.33ml，1.0MTris-HCl pH=6.8 250ul，10%SDS 20ul，10%APS 20ul，TEMED 2ul。灌入浓缩胶后，立即插入凝胶梳子，避免疏孔位置有气泡，如有气泡轻轻倾斜梳子，轻拍排出气泡，待胶凝结之后备用。

4.制样：

 5*Loading Buffer 平衡至室温，需使其中的SDS充分溶解，观察融化后的Loading应呈现澄清透亮的蓝紫色状态。按照1:5的比例加入到调整好浓度的样品中，反复轻柔吹打，使枪头中的Loading与蛋白溶液充分融合。样品管插入浮漂板中，沸水浴10mins，置于冰上将样本冷却，混匀后分装样本，储存于-80℃冰箱中保存。

5.上样与电泳：

  通过预实验，找出一个合适的上样量的范围，上样前需要检查胶孔是否堵塞，电泳条件：浓缩胶恒压80V，待溴酚蓝跑出浓缩胶后，调整电压为120V，待溴酚蓝跑至胶板最下端后，即可停止电泳，电泳时在电泳槽外加入冰块或冰袋，避免长时间电泳造成电极与溶液温度过高。

6. 转膜：

  电泳结束后，使用起胶器，轻轻取下凝胶，去除浓缩胶部分，只保留分离胶，打开转膜夹芯，先放一层海绵垫，再放三张浸润平衡过转膜液的中速滤纸，小心在滤纸上放上凝胶，剪裁合适尺寸的NC膜，完全覆盖凝胶，再加三张滤纸，使用凝胶滚筒反复轻柔赶走去除其中可能存在的气泡，整个过程不时滴加转膜液，以保持整个三明治夹心结构湿润。之后将整个转膜芯放入转膜槽，加满提前4度冰箱预冷的转膜液，外槽中放入冰冻好的冰盒用于降温。

  湿转法转膜条件： 300mA恒流，转膜时间以目的蛋白分子大小而定，每1kDa分子的转膜时间为1分钟，如该目的蛋白分子量大小为100kDa，则需要转膜100mins。

7. 封闭：

  使用TBST洗涤转膜后的膜5分钟，弃去洗涤液，加入封闭液；通常使用的封闭液有5%的BSA以及5%脱脂奶粉/TBST；磷酸化蛋白需使用BSA封闭，非磷酸化蛋白可以使用脱脂奶粉封闭。

8. 孵育一抗：

一抗孵育：用抗体稀释液稀释一抗（抗体稀释液通常与封闭液相同），放4℃摇床过夜。稀释的比例参考说明书，以1:500稀释为例，即8ul抗体原液加入4000ul抗体稀释液中，4000ul稀释好的抗体工作液，足够浸没孵育一张膜。

详情请见数据分析表抗体信息表

  第二日从4度拿出膜，在摇床室温平衡15mins，待溶液恢复室温之后吸弃抗体孵育液，加入5ml TBST洗膜3次，每次5mins；最后一次洗完后，倒去TBST，将孵育盒反扣在吸水纸上，吸取残留的液体，准备加二抗；

9. 孵育二抗：

  用抗体稀释液稀释二抗，加入识别对应一抗的HRP标记二抗，如一抗的宿主为Mouse，则二抗使用Goat-Anit-Mouse IgG-HRP，1：5000稀释；室温轻摇1h10mins，吸去二抗，加入5mlTBST洗膜3次，每次5mins，最后一次洗完，不要倒掉TBST，将洗好的膜浸没其中，放4度平衡10mins后曝光。

10. ECL曝光:

  本次实验使用自动曝光，使用前，化学发光仪进行预冷处理，将膜放进仪器的暗室照相平台上，充分滴加发光液，关好箱门，进行自动曝光并拍摄照片。