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化合物对细菌侵袭粘附抑制测试

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（一）服务内容

2个化合物对5种细菌在RAW 264.7细胞中的侵袭粘附抑制测试，总计十次测试。具体操作如下：

（1）对照组设置：470 μL包含单层贴壁细胞的DMEM培养基中加入5 μL 2% v/v DMSO的PBS溶液，混匀，接种25 μL 5 × 10⁷ CFU/mL细菌；

（2）细菌粘附组设置：将470 μL单层贴壁细胞的DMEM培养基分别加入5uL含有不同浓度化合物和2% v/v DMSO的PBS溶液（化合物终浓度为50 μM, 10 μM, 1 μM）并接种25 μL 5 × 10⁷ CFU/mL细菌；

（3）将包含对照组及细菌粘附组的24孔细胞培养板在37℃, 5% CO₂下孵育3小时；

（4）用HBSS洗涤受感染的单层细胞6次，通过加入1% v/v Triton X-100的PBS溶液并磁力搅拌10分钟充分破坏细胞。通过稀释涂布平板法来确定侵袭和粘附的细菌总量（CFU/mL），每个梯度计数重复三次；

化合物对细菌侵袭的抑制通过如下操作确定：

（1）在经过如上所述的3小时孵育后，感染的单层细胞用HBSS洗涤六次，然后添加含有100 mg/L庆大霉素的DMEM培养基以杀死所有外部细菌；

（2）将24孔细胞培养板再培养2小时，通过加入含有1% v/v Triton X-100的PBS溶液并磁力搅拌10分钟充分破坏细胞，并通过稀释涂布平板法确定侵袭的细菌总量（CFU/mL）。