【背景简介】

细胞凋亡（Apoptosis）是指细胞程序性死亡，是研究细胞信号转导及功能的重要研究方向。磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）分布于正常细胞的细胞膜脂质层内侧，但在细胞凋亡早期时，PS会发生外翻，使PS暴露在细胞膜外表面。Annexin V是一种分子量约35KDa的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与PS具有高度的亲和力。因此，带有荧光标记（如PE）的Annexin V可与发生外翻的PS结合，是检测细胞早期凋亡的主要指标之一。

7-AAD （7-amino-actinomycin D）是一种核酸染料，它不能通过正常细胞膜，但在细胞凋亡及死亡过程中，细胞膜对7-AAD的通透性逐渐增加，从而可结合DNA。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI 的最佳替代品。

综上所述，采用带有荧光标记的Annexin V与7-AAD双染的方法，通过流式细胞术可区分不同凋亡时期（早期或中晚期）的细胞，是细胞凋亡早期检测最常见的方法之一。

【试剂盒组份】

1.        人Annexin V-PE

体积：0.5mL(100T)/0.25mL(50T)/0.1mL(20T)。

贮存：2-8℃避光保存，勿冰冻。

2.        7-AAD Viability Staining Solution

体积：1.0mL(100T)/0.5mL(50T)/0.2mL(20T)。

贮存：2-8℃避光保存，勿冰冻。

3.        结合缓冲液 10x (Binding Buffer 10x)

体积：8mL(100T)/4mL(50T)/2mL(20T)。

贮存：2-8℃保存，勿冰冻。

【需要但未提供的仪器/试剂】：

1.        流式细胞仪，离心机，加样枪，离心管

2.        去离子水，PBS，不含EDTA的胰酶消化液

【操作流程（流式细胞仪）】

1. 样本处理：

a)对于贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化细胞后（避免胰酶过度消化），轻轻吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µL左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1mL在4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

b)对于悬浮细胞：1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µL左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1mL在4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

2.  用去离子水按1:10稀释结合缓冲液（如2mL结合缓冲液+18mL去离子水）；

3.  用4℃预冷的PBS洗细胞两次，用250uL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×10⁶/mL；

4.  取100mL的细胞悬液于5mL流式管中，加入5mL Annexin V-PE，混匀后于室温避光孵育5 min；

5.  加入10mL的7-AAD溶液；

6.  在反应管中加400mL PBS，在1 hour内流式细胞仪（FACS）分析。

【注意事项】

1. 由于检测细胞种类、操作习惯、仪器型号等差异，各试剂组份使用量可在推荐使用量的基础上做适当优化，以取得更好的实验结果；

2. 本试剂盒适用于检测细胞样本，不推荐用于组织样本的检测，固定后的样本不能用于检测；

3.所有试剂使用前均需短暂离心，防止液体挂壁导致试剂量不足；

4.避免用力吹打细胞；

5. 流式细胞仪检测凋亡时，每次独立实验应包含未处理细胞的Annexin V-PE单阳性管、7-AAD单阳性管，用于荧光补偿调节。

6. 此产品仅供科学研究用途，不可用于临床诊断。

【有效期】 参见试剂盒标注。