【背景简介】

细胞凋亡（Apoptosis）是指细胞程序性死亡，是研究细胞信号转导及功能的重要研究方向。磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）分布于正常细胞的细胞膜脂质层内侧，但在细胞凋亡早期时，PS会发生外翻，使PS暴露在细胞膜外表面。Annexin V是一种分子量约35KDa的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与PS具有高度的亲和力。因此，当细胞发生凋亡时，带有荧光标记（如FITC）的Annexin V可与发生外翻的PS结合，从而作为检测细胞早期凋亡的主要指标之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide， PI）是一种核酸染料，它不能通过正常细胞膜，但当细胞处于坏死或凋亡中晚期状态下，细胞则失去膜完整性，PI会进入细胞内部，与细胞核内的核酸发生结合，从而可以显示细胞的状态。

综上所述，采用带有荧光标记的Annexin V与PI双染的方法，通过流式细胞术可区分不同凋亡时期（早期或中晚期）的细胞，是细胞凋亡早期检测最常见的方法。

【试剂盒组份】

1.        人Annexin V-FITC

体积：0.5mL(100T)/0.25mL(50T)/0.1mL(20T)。

贮存：2-8℃避光保存，勿冰冻。

2.        碘化丙锭溶液 （Propidium Iodide, PI）

体积：1.0mL(100T)/0.5mL(50T)/0.2mL(20T)。

贮存：PI为有毒试剂，操作时需佩戴手套，2-8℃避光保存，勿冰冻。

3.        结合缓冲液 10x (Binding Buffer 10x)

体积：8mL(100T)/4mL(50T)/2mL(20T)。

贮存：2-8℃保存，勿冰冻。

【需要但未提供的仪器/试剂】：

1.        流式细胞仪，离心机，加样枪，离心管

2.        去离子水，PBS，不含EDTA的胰酶消化液

【操作流程（流式细胞仪）】

1. 样本处理：

a)对于贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化细胞后（避免胰酶过度消化），轻轻吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µL左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1mL在4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

b)对于悬浮细胞：1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µL左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1mL在4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

2.  用去离子水按1:10稀释结合缓冲液（如2mL结合缓冲液+18mL去离子水）；

3.  用4℃预冷的PBS洗细胞两次，用250uL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×10⁶/mL；

4.  取100mL的细胞悬液于5mL流式管中，加入5mL Annexin V-FITC和10mL碘化丙锭溶液；

5.  混匀后于室温避光孵育15 min；

6.  在反应管中加400mL PBS，在1 hour内流式细胞仪（FACS）分析。

【注意事项】

1. 所有试剂使用前均需短暂离心，以避免液体挂壁导致的试剂量不足及浓度不均匀；

2. 检测样品为贴壁细胞时，需去除残留胰酶，胰酶会酶解Annexin V导致染色失败；

3. 如果细胞中含有GFP，则会干扰FITC的荧光信号，因此建议选用其它荧光标记的试剂盒。

4. 本试剂盒适用于检测细胞样本，不推荐用于组织样本的检测，固定后的样本不能用于检测；

5. 由于检测细胞种类、仪器型号、操作习惯等差异，各试剂组分使用量可在推荐使用量的基础上进行优化，以取得更好的实验结果；

6.每次独立的流式上机应包含未处理细胞的Annexin V-FITC单阳性管、PI单阳性管，用于荧光补偿调节。

7. 此产品仅供科学研究用途，不可用于临床诊断。

【有效期】 参见试剂盒标注。