操作步骤： 1. 请根据样品种类进行以下步骤（1a为动物细胞，1b为动物组织） 1a.收集动物细胞：悬浮细胞可直接300×g离心5min并仔细吸除上清留沉淀待使用；单层贴壁细胞可通过直接裂解法（吸尽培养基留下贴壁细胞，待步骤2用Buffer RN裂解）或胰酶处理法（吸尽培养基留下贴壁细胞，用PBS清洗细胞，吸除PBS后使用含0.10%-0.25%胰酶使细胞脱落，加入含有血清的培养基使胰酶失活后转入无酶1.5ml离心管中300×g离心5min，吸除上清留沉淀待使用） 注意：收集细胞数量不要超过1×107，收集细胞时一定要将细胞培养基去除干净，可使用PBS清洗1-2次，否则会导致步骤2时细胞裂解不完全，影响RNA与吸附柱的结合，RNA的产量降低。 1b.动物组织匀浆处理：将5mg-15mg动物组织转移入无酶1.5ml离心管中并加入200μl Buffer RN（动物组织量不要超过15mg）使用前请检查Buffer RN是否加入β-巯基乙醇，使用研磨杵或电动研磨机将动物组织彻底研磨匀浆。使用移液器将裂解物转移到无酶离心管中。在台式离心机中以最大速度离心裂解物10min，离心后将上清（即细胞质RNA）转移至新的无酶管中，沉淀用于核RNA提取。进行步骤4. 2. 加入4℃预冷的180μl BufferRN(使用前请检查Buffer RN是否加入β-巯基乙醇)至细胞沉淀中，并于冰上孵育5min。对于未消化收集的培养在3.5cm培养皿中的细胞，可吸净培养基用PBS清洗一次后，直接加入4℃预冷的180μl BufferRN至细胞培养皿中，然后用细胞刮刀轻轻刮动并转移至无酶1.5ml离心管中，并于冰上孵育5min。 对于提前离心沉淀在离心管中的细胞，通过轻弹离心管以使细胞沉淀彻底分散开。悬浮液应迅速澄清，表明质膜立即溶解。注意：细胞沉淀的不完全分散可能导致裂解效率低下和RNA产量降低。 3. 将上述裂解物在4ºC下以300×g离心2min。将上清液转移到新的无酶1.5ml离心管中用于细胞质RNA提取，沉淀用于细胞核RNA提取。如果在此过程的后续步骤中使用相同的离心机，则保持离心室温状态。 上清液含有细胞质提取物。根据细胞类型的不同，它通常略带混浊和黄白色。沉淀含有细胞核，上清中为细胞质裂解物。 4. 于步骤3中所得细胞质裂解物及细胞沉淀管中分别加入600 µl Buffer RT（使用前请检查Buffer RT是否加入β-巯基乙醇或DTT），充分涡旋混匀。 若沉淀物较多，可室温裂解3-5min，期间摇匀2-3次。 5. 将430μl无水乙醇（96–100％）分别加入两管裂解物中，并用移液器将其充分混合。不要离心。 注意：从某些细胞系纯化RNA时，加入乙醇后可能会出现沉淀。 这不会影响后续提取过程。 6. 将步骤5混匀后的两管溶液转移入无酶吸附柱中并套上2ml收集管，≥8000×g（≥10,000rpm）离心1min，弃废液，直至将溶液全部转移完成吸附。 吸附柱最大上柱量为700μl，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2ml收集管中。 7. （可选步骤）向吸附柱中央加入80μl DNase Ⅰ工作液，室温（15℃-25℃）静置15min。配制DNase Ⅰ工作液：取10μl DNase Ⅰ储备液入新的RNase-Free离心管中，并加入70μl Buffer RDD，轻柔混匀。 注意：DNase Ⅰ对物理变性特别敏感，所以混匀时请上下倒置轻柔混匀，切勿涡旋。请确认DNase Ⅰ工作液加入到正中央的柱膜上，否则DNase消化效果会不理想。 8. 向两个吸附柱中分别加入700μl Buffer RW1，≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。 9. 将两个吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入500μl Buffer RPE（使用前请确认Buffer RPE按要求加入4倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。 10. 重复步骤9一次。 11. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中,以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱子。 12. 将两个吸附柱分别套入新的RNase-Free的1.5ml离心管中，并置于无RNA酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。 若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。 13. 向两个吸附柱膜正中央分别加入30-50μl RNase-Free Water，盖上盖子室温静置3-5 min。后置于离心机中≥12,000×g(≥13,000 rpm)离心4min得到RNA溶液。