操作步骤： 1. 在适当大小的离心管中将1体积的全血与5体积的Buffer EL混合。 为了获得最佳结果，混合物的体积（血液+Buffer EL）不应超过离心管体积的3/4，以实现有效混合。例如，将5ml Buffer EL加到1ml全血中，并混入总体积为8ml以上的离心管中 注意：使用适量的全血。最多可处理1.5ml健康血液（通常每微升全血有4000-7000个白细胞）。如果使用白细胞数量增加的血液，则适当减少剂量。（在这种情况下，还要在步骤6中调整Buffer RLT的数量。） 2. 在冰上孵育10–15min。在孵育过程期间短暂涡旋2次以充分混匀。 在孵育过程中混浊的悬浮液变为半透明，表明红细胞溶解。如有必要，孵育时间可延长至20min。 3. 在4°C下以400×g离心10min，然后完全去除并丢弃上清液。 离心后白细胞将形成沉淀，确保上清液完全清除。残留痕量红细胞会使沉淀呈红色，这在随后洗涤步骤中将消除。 4. 将Buffer EL加到细胞沉淀中（根据步骤1所用血液体积计算，按每体积全血使用2体积Buffer EL）。通过短暂涡旋重悬细胞。 例如，对于在步骤1中使用1ml全血，则此步骤添加2ml Buffer EL。 5. 在4°C下以400×g离心10min，然后完全去除并丢弃上清液。 注意：上清液的不完全去除会干扰裂解以及随后的RNA与核酸吸附柱的结合，从而导致收率降低。 6. 按下表将Buffer RLT（使用前请检查Buffer RLT是否加入β-巯基乙醇）添加到沉淀的白细胞中，充分混匀涡旋30s混匀。 当使用非健康血液时，请参考白细胞的数量来确定所需的Buffer RLT的体积。Buffer RLT破坏细胞。 在继续进行均质化步骤之前，应该看不到任何细胞团块。若有细胞团块，则涡旋或移液吹打以清除。 Buffer RLT (µl) Healthy whole blood (ml) No. of leukocytes 350 Up to 0.5 Up to 2× 106 600 0.5 to 1.5 2× 106 to 1× 107 7. 将步骤6中混匀后的溶液转移入过滤柱中，最大转速(~13,400×g)离心2min，丢弃过滤柱，收集滤液。 注意：为避免气溶胶的形成，请将移液器调整到≥750µl以保证一次性将所有溶液转移到过滤柱上，如果细胞太多，将会出现裂解液粘稠的现象，造成难以吸取的情况。 8. 向滤液中加入1倍体积70%乙醇(通常为350μl或600μl)，并通过移液器吹打混匀（不要涡旋）。将得到的溶液一起转入吸附柱中（吸附柱提前放入收集管中），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。 加入乙醇后可能会形成沉淀，这不会影响后续的提取程序。吸附柱最大上柱量为700μl，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明则吸附柱均置于2ml收集管中。若不需进行DNase I消化则继续步骤11。 9. （可选步骤）向吸附柱中央加入80μl DNase Ⅰ工作液，室温（15℃-25℃）静置15min。配制DNase Ⅰ工作液：取10μl DNase Ⅰ储备液入新的RNase-free离心管中，并加入70μl Buffer RDD，轻柔混匀。 注意：DNase Ⅰ对物理变性特别敏感，所以混匀时请上下倒置轻柔混匀，切勿涡旋。请确认DNase Ⅰ工作液加入到正中央的柱膜上，否则DNase消化效果会不理想。 10. 向吸附柱中加入700μl Buffer RW1，≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。 11. 将吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入500μl Buffer RPE（使用前请确认Buffer RPE按要求加入4倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。 12. 重复步骤11一次。 13. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中,以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱膜。 14. 将吸附柱套入新的无酶1.5ml离心管管中，并置于无酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。 若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。 15. 向吸附柱膜正中央加入50-100μl RNase-free Water，盖上盖子室温静置3-5 min。后置于离心机中≥12,000×g(≥13,000 rpm)离心3min得到RNA溶液。 RNA洗脱体积不应少于30μl，否则影响洗脱效率。洗脱后的RNA溶液应置于-82℃储存。