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RT ProMix for qPCR（+gDNA clearer）（逆转录试剂盒）
【储存条件】 收到本产品后，请立即置于 -20℃保存。从 -20℃ 取 出 使 用 时， 将 冻 存 的 gDNA clearer 和 2.5× Prescript Ⅲ RT ProMix 融解，然后轻轻颠倒混匀后 短暂离心至管底，置于冰上备用。
【储存条件】 收到本产品后，请立即置于 -20℃保存。从 -20℃ 取 出 使 用 时， 将 冻 存 的 gDNA clearer 和 2.5× Prescript Ⅲ RT ProMix 融解，然后轻轻颠倒混匀后 短暂离心至管底，置于冰上备用。
【产品简介】 Prescript Ⅲ RT ProMix For qPCR （+gDNA clearer） 基 于 PreScript Ⅲ Reverse Transcriptase， 包 含 合 成高质量 cDNA 所需的所有成分，适合于两步法 RTqPCR 检测。gDNA clearer 可彻底去除残留的基因 组 DNA 污染，保证后续定量结果更加可靠；2.5× Prescript Ⅲ RT ProMix 包 含 PreScript Ⅲ Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、优化的缓冲体系、 Oligo (dT)23VN、Random hexamers、dNTPs 和 gDNA clearer 终止成分。 PreScript Ⅲ Reverse Transcriptase 是通过定点突 变得到的 RNase H 活性缺失的全新逆转录酶，该酶 的热稳定性和 cDNA 合成效率得到大幅提升，非常 适合具有复杂二级结构的 RNA 模板的逆转录，可以 在 15 min 内高效合成 qPCR 所用的模板 cDNA。。
【质量控制】 所有组分经检测均无核酸外切酶，核酸内切酶， RNase 残留。 功能检测：以 1 pg - 1 µg HeLa 细胞总 RNA 为 模板，RT-qPCR 检测高丰度基因的表达水平。 以 5-6 个数量级的模板量的对数值对 CT 值做标 准曲线并计算扩增效率，R2 >0.990，扩增效率 在 0.9 到 1.1 之间。
【实验前准备】 RNase-free 1.5 ml 离心管、0.2 ml PCR 管、移 液器吸头 移液器；PCR 仪； 高质量的完整的 RNA。对于获得高质量的 cDNA 是至关重要的，实验前请用电泳验证 RNA 的完 整性。 RT ProMix For qPCR（+gDNA clearer）
【操作方法】 1. 基因组 DNA 去除 在 RNase-free 的 PCR 管中配制如下混合液： RNase-free ddH2O 至 12 μL gDNA clearer 4 μL 模板 RNA 10 pg - 5 μg 用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心后置于 PCR 仪中 42℃孵育 2 min，冰上冷却备用。
2. 配制逆转录反应体系 在 RNase-free 离心管中配制如下混合液： 上一步反应液 12 μL 2.5× Prescript Ⅲ RT ProMix 8 μL 用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心后进行下一步 反 应。 可 选 择 设 计 No RT Control 反 应，No RT Control 是指不加逆转录酶的逆转录阴性对照反应， 用于检验 RNA 模板中是否有基因组 DNA 残留。
3．进行逆转录反应 25℃ 5 min 50℃ 15 min 85℃ 2 min 产物可立即用于 qPCR 反应，建议作为模板的 cDNA 产物的体积不超过 qPCR 反应体积的 1/10；短期存 放建议在 -20° C 保存 , 并在两个月内使用；长期存 放建议分装后在 -80℃保存；cDNA 应避免反复冻融。
【注意事项】 防止 RNase 污染。请保持实验区域洁净；操 作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的 离心管、枪头等耗材均需保证 RNase-free。 20 µL 逆转录反应体系建议加入不超过 1 µg 的 Total RNA。如果目的基因表达量非常低， 最多加入 5 µg Total RNA，否则加入 RNA 量 过高，可能会超出后续定量 PCR 的线性范围。 如 果 加 入 RNA 模 板 体 积 较 大 ( 如 超 过 2 µL)，请确保 RNA 是溶于水中而不是 TE 中， 因为 TE 中的 EDTA 会对逆转录反应产生抑制。 请勿将 gDNA clearer 与其它 RT 试剂配套使 用，因为产品所带的 2.5× Prescript Ⅲ RT ProMix 含终止 gDNA clearer 反应的成分， 其它试剂不含此成分，可能会影响后续的 qPCR 结果。 cDNA 产物可直接用作 qPCR 反应的模板。 建 议 作 为 模 板 的 cDNA 产 物 的 体 积 不 超 过 qPCR 反应体积的 1/10。